一种抗ptau181单克隆抗体及其应用的制作方法-凯发k8娱乐

本发明涉及抗体，具体地，涉及一种抗ptau181单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、tau蛋白是一组由选择性mrna剪接形成的神经元微管相关蛋白，在阿尔茨海默病（alzheimer 's disease，ad）大脑中以神经原纤维缠结的形式聚集。tau蛋白在调节微管动力学、轴突运输和轴突生长中起关键作用，所有这些功能都是通过位点特异性磷酸化来调节的。事实上，神经退行性疾病中发生的异常tau蛋白磷酸化不仅导致毒性功能丧失（例如微管结合减少），而且很可能还导致毒性功能获得（例如tau-tau相互作用增加）。

2、随着新的改善疾病的ad疗法的潜在发展，需要简单的、广泛可用的筛查试验来识别那些正在经历认知或行为衰退症状的个体，应进一步评估以开始治疗。在ad疾病进展过程中，病理改变与脑脊液tau相关物包括总tau和苏氨酸181磷酸化的tau蛋白（ptau181）浓度升高有关，ptau181水平比正常大脑中的水平高出3~4倍，而血浆中ptau181水平与脑脊液ptau181水平相关，这使得ad与非ad神经退行性疾病的鉴别成为可能。与目前使用的正电子发射断层扫描（pet）诊断测试相比，基于脑脊液或血液的ad检测是一种更易接受、成本更低的筛查工具。

3、在进行检测时，由于ptau181的低浓度，抗体的亲和力至关重要。另外，抗体特异性（将靶标与其他蛋白质区分开来的能力）与结合的紧密性同样重要。实现ptau181特异性尤其具有挑战性，因为抗体需要区分单个磷酸化残基的存在。目前，市面上只有极少ptau181的单克隆抗体（单抗）和检测方法，但检测存在检测灵敏度不高、特异性不强、检测结果与临床病理不符等问题。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，发明人以包含ptau181的多肽为抗原进行动物免疫，以另一种含ptau181的多肽和未进行磷酸化的总tau蛋白为抗原包被酶标板进行elisa筛选，制备出特异性靶向ptau181的单克隆抗体，该抗体和力高、特异性强，从而完成本发明。

2、本发明第一方面提供一种抗ptau181单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的全长氨基酸序列如seq id no. 5所示，所述轻链可变区的全长氨基酸序列如seq id no. 10所示。

3、ptau181为苏氨酸181磷酸化的tau蛋白，上述抗ptau181单克隆抗体或其抗原结合部分能够特异性靶向ptau181磷酸化位点。在本发明的一些实施方案中，所述抗ptau181单克隆抗体或其抗原结合部分能够特异性靶向包括总tau蛋白序列第173~190位氨基酸并且181位磷酸化的多肽，具有区分单个磷酸化残基的能力。

4、在本发明的一些具体实施方案中，所述抗ptau181单克隆抗体重链可变区cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列分别如seq id no. 6~seq id no. 8所示；轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no. 11~seq id no. 13所示。

5、在本发明的一些具体实施方案，所述抗ptau181单克隆抗体为基因重组抗体。

6、在本发明的一些具体实施方案，所述抗原结合部分选自fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段和scfv片段。

7、其中，自fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段是可以从igg和igm的可变区产生的抗原结合部分。f(ab')2片段包含两个抗原结合区，通过二硫键在铰链处连接；fab'片段可通过还原f(ab')2片段形成，即fab'片段衍生自f(ab')2片段；fab片段是由igg和igm产生的单价片段，由通过分子内二硫键连接的vh、ch1和vl、cl区组成；fv片段是由igg和igm产生的最小片段，包含完整抗原结合位点。fv片段具有与fab相同的结合特性和相似的三维结合特性。

8、单链抗体（single-chain variable fragment，scfv）是由抗体重链的可变区与轻链的可变区在一段肽链的连接下构成的小分子，是具有抗体活性的最小功能结构单位。

9、本发明第二方面提供编码本发明第一方面任一所述的抗ptau181单克隆抗体或其抗原结合部分的基因，编码重链可变区全长的基因包括seq id no. 4所示核苷酸序列，编码轻链可变区全长的基因包括seq id no. 9所示核苷酸序列。

10、本发明第三方面提供一种重组载体，包括本发明第二方面所述的编码本发明第一方面任一所述的抗ptau181单克隆抗体或其抗原结合部分的基因。

11、重组载体可以指克隆载体，也可以指表达载体，可以通过将编码核酸与商购的载体（如质粒或病毒载体）可操作地连接而获得，本发明中的重组载体不受特别限制，常用的质粒均可使用，如psetag2、pee14、pmh3、pcdna3.1、pcdna3.4等。

12、在本发明的一些实施方案如此，分别将编码重链可变区全长的核酸和编码轻链可变区全长的核酸连接至不同的表达载体上，得到两种重组载体。

13、在本发明的一些具体实施方案中，将小鼠重链信号肽、重链可变区全长、小鼠igg1恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcdna3.4的多克隆位点，形成表达重链可变区的重组载体；将小鼠kappa链信号肽、轻链可变区全长、小鼠kappa链恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcdna3.1 zeo( )的多克隆位点，形成表达轻链可变区的重组载体。

14、在本发明的一些优选实施方案中，所述小鼠重链信号肽氨基酸序列如seq id no.14所示，其核苷酸序列如seq id no. 15所示；所述小鼠igg1恒定区氨基酸序列如seq idno. 16所示，其核苷酸序列如seq id no. 17所示。

15、在本发明的一些优选实施方案中，所述小鼠kappa链信号肽氨基酸序列如seq idno. 18所示，其核苷酸序列如seq id no. 19所示；所述小鼠kappa链恒定区氨基酸序列如seq id no. 20所示，其核苷酸序列如seq id no. 21所示。

16、本发明第四方面提供一种重组细胞，包括本发明第三方面所述的重组载体。

17、所述重组细胞携带前面所述的基因、重组载体或转化子、或抗ptau181单克隆抗体或抗原结合片段。所述重组细胞是通过转染或者转化所述重组载体获得的。

18、在本发明的一些实施方案中，将上述表达重链可变区的重组载体和表达轻链可变区的重组载体按1:1的比例使用脂质体转染试剂进行转染得到重组细胞。

19、根据本发明的实施例，所述重组细胞在适合条件下可高效表达上述抗ptau181单克隆抗体。

20、需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括bhk细胞、cho细胞、ns0细胞或cos细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。

21、需要说明的是，本技术说明书中所述的“适合条件”，是指适合本技术所述抗ptau181单克隆抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合抗ptau181单克隆抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗ptau181单克隆抗体表达的条件。

22、本发明第五方面提供本发明第一方面任一所述的抗ptau181单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于检测ptau181的试剂盒中的应用。

23、在本发明的一些实施方案中，检测ptau181的方法包括但不限于ihc法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法和流式细胞法。

24、在本发明的一些实施方案中，利用所述抗ptau181单克隆抗体和抗tau蛋白抗体组合基于流式细胞法检测生物样本中的ptau181。

25、在本发明一些具体实施方案中，将所述抗ptau181单克隆抗体和所述抗tau蛋白抗体中的一种偶联微球，另一种偶联藻红蛋白荧光素。其中：

26、偶联微球步骤为：取浓度5×107个/ml荧光微球0.1ml，加入pbst缓冲液清洗2次，在清洗后的第一荧光微球中加入100μg的edc和50μg的nhs放置30分钟以活化微球，加入100μg抗体在室温旋转反应5小时，清洗第一荧光微球去除多余抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入ph为7.2的tris缓冲液保存，制得偶联微球的抗体溶液。

27、偶联藻红蛋白荧光素步骤为：取抗体与藻红蛋白荧光素以摩尔比1:30的比例在室温下震荡孵育5小时，以50k超滤管添加浓度为0.01mol/l的pbs溶液清洗3次以去除多余未结合藻红蛋白荧光素，得到荧光标记的抗体溶液。

28、在本发明的一些优选实施方案中，利用抗tau蛋白抗体微球和藻红蛋白荧光素标记的所述抗ptau181单克隆抗体进行检测。

29、所述流式细胞法的检测步骤为：分别向流式管中加入偶联微球的抗体溶液、生物样本、荧光标记的抗体溶液，充分混合均匀，室温避光静置2.5h；加入洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，离心去上清震荡器震荡30s以上，加入300μl的1×洗涤缓冲液在流式细胞仪上检测荧光信号强度。

30、本发明第六方面提供一种用于检测ptau181的试剂盒，包括本发明第一方面任一所述的抗ptau181单克隆抗体或其抗原结合部分，或包括本发明第一方面任一所述的抗ptau181单克隆抗体或其抗原结合部分以及抗tau蛋白抗体。

31、在本发明中，检测ptau181的存在或水平进一步用于相关疾病的预测、诊断、动态监测及预后评估。所述相关疾病选自阿尔茨海默病、路易体痴呆和额颞叶变性中的一种。

32、本发明的有益效果

33、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

34、本发明的抗ptau181单克隆抗体具有亲和力高、特异性强的特点。利用本发明的抗ptau181单克隆抗体或其抗原结合部分与抗tau蛋白抗体组合检测脑脊液或血液中的ptau181含量时，具有灵敏度高、特异性强、检测结果可靠的优势，有助于阿尔茨海默病等相关疾病的预测、诊断、动态监测及预后评估，具有非常高的临床应用价值。