双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物基因工程领域，具体的，本发明涉及双基因敲除重组红球菌及 其构建方法，更具体的，本发明涉及一种构建双基因敲除的红球菌的构建方法、一种双基因 敲除重组红球菌、一种构建高表达腈水解酶重组红球菌的方法、一种高表达腈水解酶重组 红球菌、高表达腈水解酶重组红球菌在制备羧酸类化合物中的用途以及一种制备丙烯酸铵 的方法。
【背景技术】
[0002] 红球菌是一种好氧的革兰氏阳性放线菌，具有相对较快的生长速率。由于具有强 大的酶和代谢物合成能力，以及对有机溶剂的良好耐受性，红球菌广泛应用于化学品、医药 产品等的生物制备。尤其是高表达腈水合酶的红色(赤)红球菌(rhodococcus ruber)或紫 红红球菌(rhodococcus rhodochrous)游离细胞，已经成功用于丙稀酰胺、烟酰胺等化学品 的工业生物催化生产。
[0003] 腈水解酶(nitrilase)、酰胺酶(amidase)和腈水合酶(nitrilehydratase)，是腈 代谢酶系的三种典型工业酶，广泛用于合成各种重要化学品和医药中间体。例如，微生物腈 水解酶可以直接催化一分子丙烯腈与两分子水发生水合反应，生成丙烯酸和氨(赵孝先等， 山东大学学报，1994,29(2):43~46)，在中性和弱酸、弱碱性溶液中都表现为丙稀酸铵。该 催化反应在常温常压下进行，能耗低，操作简单、安全;丙烯腈转化率高，生成产物单一。此 外，腈水解酶还用于利普妥药物中间体、苦杏仁酸、苯甲酸、羟基乙酸等产品的生物合成。因 此，对于腈水解酶的结构、性能和应用研究也受到广泛重视（徐建妙等，微生物学通报， 2005,32(5): 141~146)。第一个能产腈水解酶的微生物菌种是由hook和robinson利用天然 腈化合物蓖麻碱作为唯一碳源筛选得到的假单胞菌(pseudomonas)，此后有许多研究者利 用特定的腈化合物作为唯一碳源或者唯一氮源筛选到一系列能产腈水解酶的细菌和真菌。 日本利用紫红红球菌r.rhodochrousj1产生的腈水解酶催化丙稀腈生产丙稀酸，在丙稀腈 浓度较低的条件下，其腈水解酶酶活为18.4u/ml，经过连续24小时的补加丙烯腈进行催化， 丙稀酸的浓度累积到3928凡(似8&8&￥&，6七&1.41'(：11]\1;[(31'013；[01，1988，150:89~94)。王铁 钢等人则对菌株r.rhodochroustgl-a6进行了紫外诱变和培养基优化，腈水解酶活性达到 26.77u/ml，经过10小时的补加丙烯腈连续催化，丙烯酸累积浓度达到414.2g/l(罗晖等，现 代化工，2006,26(s2):109~113;王铁钢等，生物加工过程，2007,5(1):41~44)。
[0004] 与腈水解酶相比，腈水合酶的研究更为广泛，且腈水合酶催化生产丙烯酰胺的生 物路线已经成功实现产业化生产。在红色红球菌th中，腈水合酶的表达量可高达总蛋白量 的80 %左右。
[0005] 由于成本、原料价格、腈水解酶活性和催化工艺等因素的影响，采用腈水解酶催化 的生物法生产丙烯酸(铵）尚未普遍应用。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。
[0007] 依据本发明的一方面，本发明提供一种构建双基因敲除的重组红球菌的方法，包 括步骤：（1)根据所述红球菌的腈水合酶基因序列，设计引物以分别扩增所述腈水合酶基因 的上游序列和所述腈水合酶基因的下游序列，获得所述腈水合酶基因的上游片段和所述腈 水合酶基因的下游片段；（2)将（1)中的腈水合酶基因的上游片段和腈水合酶基因的下游片 段插入到自杀质粒中，获得重组自杀质粒，所述自杀质粒携带卡那霉素抗性基因和蔗糖果 聚糖酶基因；（3)利用(2)中的重组自杀质粒转化敲除了酰胺酶基因的重组红球菌的感受态 细胞，获得所述双基因敲除的重组红球菌，其中包括，通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选， 获得第一重组菌落，通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行第二轮筛选，以获得所述双基 因敲除的重组红球菌。
[0008] 利用上述本发明的这一方面的方法，能够高效的构建出双基因敲除的重组红球 菌，即高效的构建出同时敲除了酰胺酶基因和腈水合酶基因的重组红球菌。构建出的该双 基因敲除的重组红球菌可以作为宿主细胞，用于插入目的基因片段使目的基因得以高效表 达。
[0009] 根据本发明的实施例，上述本发明一方面的构建双基因敲除的重组红球菌的方法 还可以具有以下附加技术特征至少之一：
[0010] 所称的红球菌可以选自目前已知的红球菌，本发明对此不作限制。根据本发明的 一个实施例，所称的红球菌选自红色红球菌红色红球菌rhodococcusruberth(r.ruber τη)和th3中的一种。红色红球菌r.ruberτη和th3的生长周期短、酶的表达效率高、工业化 生产工艺成熟，具有很好的工业应用价值。此外，在红色红球菌τη和τη3中，天然的腈水解酶 基因几乎不表达，腈水解酶活性几乎为零。
[0011]所称的自杀质粒(suicideplasmid)，通常为r质粒的衍生质粒，常有宿主范围广 的特点，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白 质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制、被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一 起复制。利用自杀质粒的这个特点，将基因工程技术构建的基因缺失的dna片段，克隆入自 杀质粒，利用缺失基因两端的同源片段，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性dna片段可 发生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。根据本发明的一个实施例，（2)中的自杀质粒选 自pkl8mob_sacb和其衍生质粒中的一种。
[0012] 根据本发明的一个实施例，所称的敲除了酰胺酶基因的重组红球菌为敲除了酰胺 酶基因的th3红色红球菌，可表示为th3(amda-）。该工程菌株是清华大学为了减少红球菌 th腈水合酶催化丙烯腈生产丙烯酰胺过程中的副产物(丙烯酸)积累，采用同源单交换重组 的方法，敲除了染色体上的酰胺酶基因获得的基因工程菌株(zl200880000969.1;w02009/ 117843;us12/933，725)。将th3(amda-）菌株用于催化生产丙烯酰胺，副产物丙烯酸的生成 量降低了80% 以上（maetal.bioresourcetechnology，2010,101(1):285_291)〇
[0013] 根据本发明的一个实施例，（1)中的腈水合酶基因的上游片段带有酶切位点 ecori/xbai，（l)中获得的腈水合酶基因的下游片段带有酶切位点xbal/hindlll。使得在步 骤(2)中，能够通过双酶切将腈水合酶基因的上游片段和下游片段插入到自杀质粒中。
[0014] 根据本发明的一个较佳实施例，（1)中的扩增所述腈水合酶基因的上游片段的引 物具有如seqidno: 1和2所示的序列，所述腈水合酶基因的上游片段具有如seqidn0:3 所示的序列，和/或（1)中的扩增所述腈水合酶基因的下游片段的引物具有如seqidn0:4 和5所示的序列，所述腈水合酶基因的下游片段具有如seqidn0:6所示的序列。通过上述 设计的特定的引物引入酶切位点，使获得的上下游片段分别带有ecori/xba頂每切位点和 xbal/hindin酶切位点。
[0015] 根据本发明的一个实施例，（3)为利用电穿孔进行所述重组自杀质粒转化。
[0016] 根据本发明的一个较佳实施例，（3)中的通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得 第一重组菌落，包括:利用含卡那霉素20微克/毫升的lb固体平板进行所述第一轮筛选，获 得在所述卡那霉素20微克/毫升的lb固体平板上生长的红色菌落为所称第一重组菌落。含 卡那霉素的平板上出现红色菌落，说明质粒上携带的腈水合酶基因上下游片段已经和染色 体发生单交换同源重组，携带卡纳霉素抗性基因的自杀质粒基因插入了染色体。
[0017]根据本发明的一个较佳实施例，（3)中的通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行 第二轮筛选，以获得所述双基因敲除的重组红球菌，包括:利用含蔗糖10%的lb固相平板对 所述红色菌落进行所述第二轮筛选，获得在含蔗糖10%的lb固相平板上生长的菌落;分别 通过含卡那霉素20微克/毫升的lb固体平板和不含卡那霉素的lb固相平板对所述在含蔗糖 10%的lb固相平板上生长的菌落进行筛选，获得在所述含卡那霉素20微克/毫升的lb固体 平板上不生长、在所述不含卡那霉素的lb固体平板上生长的菌落为所述双基因敲除的重组 红球菌。随机挑选3个预计为双基因敲除的菌落进行pcr和测序验证，结果显示菌落染色体 上没有酰胺酶和腈水合酶，证实为双基因敲除菌，说明酰胺酶-腈水合酶基因敲除型重组红 色红球菌thdadn构建以及筛选成功。
[0018] 依据本发明的另一方面，提供一种双基因敲除的重组红球菌，其利用上述本发明 一方面或者任一实施例中的构建双基因敲除的重组红球菌的方法构建获得。该双基因敲除 的重组红球菌可以作为宿主细胞，用于插入目的基因片段使目的基因得以高效表达。
[0019]依据本发明的又一方面，提供一种构建高表达腈水解酶重组红球菌的方法，该方 法包括:构建尚表达臆水解酶的质粒，获得尚表达臆水解酶质粒;利用所述尚表达臆水解酶 质粒转化双基因敲除的重组红球菌的感受态细胞，以获得所述高表达腈水解酶重组红球 菌，所述双基因敲除的重组红球菌利用上述本发明一方面或者任一实施例中的构建双基因 敲除的重组红球菌的方法构建获得。
[0020] 本发明的这一方面的方法，利用上述本发明一方面或者任一实施例的方法构建的 双基因敲除的重组红球菌可以作为宿主细胞，利用克隆高表达腈水解酶基因以及构建高表 达腈水解酶的质粒，将高表达腈水解酶的质粒转化进宿主细胞中，使获得能够高表达腈水 解酶的重组红球菌。
[0021] 根据本发明的实施例，所述构建高表达腈水解酶的质粒包括:设计引物对以扩增 紫红红球菌的腈水解酶基因，获得腈水解酶基因扩增产物;将所述腈水解酶基因扩增产物 插入到大肠杆菌-红球菌穿梭质粒中，以获得所述高表达腈水解酶质粒。
[0022] 所称穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以 在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间， 也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pbe2、酵母的ppic9k、哺乳动物表达 载体pmt2和用于植物细胞的ti质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可 以在相应的枯草、酵母