具有反向末端重复序列的封闭末端dna产生的制作方法-凯发k8娱乐

背景技术：

1、基因疗法提供了治疗多种疾病的持久手段的可能性。过去，许多基因疗法通常依赖于使用病毒载体。有多种可以选择用于这个目的的病毒剂，每种病毒剂具有不同特性，这使得它们更适合于或更不适合于基因疗法。然而，一些病毒载体的不期望的特性已经导致了临床安全性问题并且限制了它们的治疗用途。

2、腺相关病毒(aav)是一种常见的基因疗法载体，但是它并非没有缺点。aav基因组的编码序列侧接反向末端重复序列(itr)，所述反向末端重复序列是病毒复制和包装以及转基因表达所需。aav itr的t形发夹结构易于由宿主细胞蛋白质结合，抑制aav载体中的转基因表达。需要提供靶序列的有效且持久的表达，同时避免现有aav载体技术的局限性。

技术实现思路

1、本文公开了核酸分子及其用途，所述核酸分子包含位于包含异源多核苷酸序列的基因盒两侧的第一反向末端重复序列(itr)和/或第二itr。

2、在一方面，本文提供了包含位于包含异源多核苷酸序列的基因盒两侧的第一itr和第二itr的核酸分子，其中所述第一itr和第二itr是博卡病毒itr或其片段/衍生物(例如人博卡病毒1itr)。在另一方面，本文提供了包含第一itr和第二itr的核酸分子，其中第一itr包含与seq id no:1至少约75％相同的多核苷酸序列，并且第二itr包含与seq id no:2至少约75％相同的多核苷酸序列。

3、在一些实施方案中，第一itr包含与seq id no:1至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方案中，第一itr包含seq id no:1中所示的多核苷酸序列。在一些实施方案中，第一itr包含与seq id no:1至少约50％相同的多核苷酸序列。

4、在一些实施方案中，第二itr包含与seq id no:2至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方案中，第二itr包含seq id no:2中所示的多核苷酸序列。在一些实施方案中，第一itr包含与seq id no:2至少约50％相同的多核苷酸序列。

5、在一些实施方案中，第一itr包含seq id no:1中所示的多核苷酸序列，并且第二itr包含seq id no:2中所示的多核苷酸序列。

6、在一些实施方案中，核酸分子还包含基因盒，所述基因盒包含异源多核苷酸序列和至少一个表达控制序列，如启动子、增强子、内含子、转录终止信号或转录后调节元件。

7、在一些实施方案中，基因盒还包含启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述启动子驱动所述异源多核苷酸序列在器官中的表达，其中所述器官包括肌肉、中枢神经系统(cns)、眼睛、肝脏、心脏、肾脏、胰腺、肺、皮肤、膀胱、泌尿道、脾脏、髓系细胞谱系和淋巴样细胞谱系或其任何组合。在一些实施方案中，所述启动子驱动所述异源多核苷酸序列在以下细胞中的表达：肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、窦状细胞、传入神经元、传出神经元、中间神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小神经胶质细胞、室管膜细胞、肺上皮细胞、许旺细胞、卫星细胞、感光细胞、视网膜神经节细胞、t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任何组合。在一些实施方案中，所述启动子定位于所述异源多核苷酸序列的5'。在一些实施方案中，所述启动子是小鼠甲状腺素转运蛋白启动子(mttr)、天然人因子viii启动子、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(haat)、人白蛋白最小启动子、小鼠白蛋白启动子、三重四脯氨酸(ttp)启动子、casi启动子、cag启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、α1-抗胰蛋白酶(aat)、肌肉肌酸激酶(mck)、肌球蛋白重链α(αmhc)、肌红蛋白(mb)、结蛋白(des)、spc5-12、2r5sc5-12、dmck、tmck或磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子。

8、在一些实施方案中，所述基因盒还包含内含子序列。在一些实施方案中，所述内含子序列定位于所述异源多核苷酸序列的5'。在一些实施方案中，所述内含子序列定位于所述启动子的3'。在一些实施方案中，所述内含子序列包含合成内含子序列。

9、在一些实施方案中，所述基因盒还包含转录后调节元件。在一些实施方案中，所述调节元件定位于异源多核苷酸序列的3'。在一些实施方案中，所述调节元件包含突变的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)、微小rna结合位点、dna核靶向序列或其任何组合。

10、在一些实施方案中，所述基因盒还包含3'utr多聚(a)尾序列。在一些实施方案中，所述3'utr多聚(a)尾序列选自bgh多聚(a)、肌动蛋白多聚(a)、血红蛋白多聚(a)及其任何组合。

11、在一些实施方案中，所述基因盒还包含增强子序列。在一些实施例中，所述增强子序列定位于第一itr与第二itr之间。

12、在一些实施方案中，所述核酸分子从5'至3'包含：所述第一itr、所述基因盒和所述第二itr；其中所述基因盒包含组织特异性启动子序列、内含子序列、所述异源多核苷酸序列、转录后调节元件和3'utr多聚(a)尾序列。

13、在一些实施方案中，所述基因盒从5'至3'包含：组织特异性启动子序列、内含子序列、所述异源多核苷酸序列、转录后调节元件和3'utr多聚(a)尾序列。

14、在一些实施方案中，所述基因盒是单链核酸。在一些实施方案中，所述基因盒是双链核酸。

15、在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码治疗性蛋白质。

16、在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码凝血因子、生长因子、激素、细胞因子、抗体、其片段或其任何组合。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码凝血因子。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码生长因子。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码激素。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码细胞因子。

17、在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码fviii蛋白。

18、在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码x连锁抗肌萎缩蛋白、mtm1(肌微管素)、酪氨酸羟化酶、aadc、环水解酶、smn1、fxn(共济蛋白(frataxin))、gucy2d、rs1、cfh、htra、arms、cfb/cc2、cnga/cngb、prf65、arsa、psap、idua(mps i)、ids(mps ii)、pah、gaa(酸性α-葡糖苷酶)、galt、otc、cmd1a、lama2或其任何组合。

19、在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码微小rna(mirna)。在一些实施方案中，所述mirna下调包括以下的靶基因的表达：sod1、htt、rho、cd38或其任何组合。

20、在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码凝血因子，其中所述凝血因子包含因子i(fi)、因子ii(fii)、因子iii(fiii)、因子iv(fiv)、因子v(fv)、因子vi(fvi)、因子vii(fvii)、因子viii(fviii)、因子ix(fix)、因子x(fx)、因子xi(fxi)、因子xii(fxii)、因子xiii(fxiii)、血管性血友病因子(vwf)、前激肽释放酶、高分子量激肽原、纤连蛋白、抗凝血酶iii、肝素辅因子ii、蛋白质c、蛋白质s、蛋白质z、蛋白质z相关蛋白酶抑制剂(zpi)、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tpa)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(pai2)或其任何组合。

21、在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列经密码子优化。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列经密码子优化以用于在人体内表达。

22、在一些实施方案中，将所述核酸分子与递送剂一起配制。在一些实施方案中，所述递送剂包括脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒是可电离的。在一些实施方案中，所述递送剂包括脂质体、非脂质聚合物分子、内体或其任何组合。

23、在一些实施方案中，所述核酸分子被配制用于静脉内、经皮、皮内、皮下、肺部、神经内、眼内、鞘内、口服施用或其任何组合。在一些实施方案中，所述核酸分子被配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，所述核酸分子被配制用于通过原位注射施用。在一些实施方案中，所述核酸分子被配制用于通过吸入施用。

24、在另一方面，本文提供了一种载体，所述载体包含本文所述的核酸分子。

25、在另一方面，本文提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述的核酸分子或本文所述的载体。在一些实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。

26、在另一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的核酸分子。

27、在另一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的载体和药学上可接受的赋形剂。

28、在另一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。

29、在另一方面，本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的核酸分子和用于向有需要的受试者施用所述核酸分子的说明书。

30、在另一方面，本文提供了一种杆状病毒系统，所述杆状病毒系统用于产生本文所述的核酸分子。

31、在一些实施方案中，所述核酸分子是在昆虫细胞中产生的。

32、在另一方面，本文提供了一种纳米颗粒递送系统，所述纳米颗粒递送系统包含本文所述的核酸分子。

33、在另一方面，本文提供了一种在有需要的受试者体内表达异源多核苷酸序列的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的核酸分子、本文所述的载体或本文所述的药物组合物。

34、在另一方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的核酸分子、本文所述的载体或本文所述的药物组合物。

35、在一些实施方案中，将所述核酸分子通过静脉内、经皮、皮内、皮下、口服、肺部、神经内、眼内、鞘内或其任何组合施用。在一些实施方案中，所述核酸分子是静脉内施用的。在一些实施方案中，所述核酸分子是通过原位注射施用。在一些实施方案中，所述核酸分子是通过吸入施用。

36、在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。