一种新型耐热糖苷水解酶mtcel3及其编码序列和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程，具体地说是一种以嗜热毁丝菌myceliophthora thermophila糖苷水解酶基因mtcel3表达的高效耐热糖苷水解酶mtcel3及其编码序列和 应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 糖苷水解酶（英语：glycoside hydrolases，又称糖苷酶）是一种专门水解配糖键 (glycosidic bond)，并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这 类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可 用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。
[0003] 嗜热毁丝菌myceliophthora thermophila是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。 该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50°c条件下可以产生热稳定的纤维素酶和糖苷 水解酶。
[0004] 嗜热毁丝菌产生的耐热糖苷水解酶mtcel3具有很强的纤维素酶活性，可有效地 把长链纤维素分解为寡糖，目前为止尚未有关于此酶的任何报道。mtcel3对羧甲基纤维素 的水解活力尚达47. 5 lu/mg，具有很尚的纤维素水解能力。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明从嗜热毁丝菌myceliophthora thermophila获得duf4360超家族耐热糖 苷水解酶基因的cdna序列全长，命名为mtcel3,基因cdna全长627bp，编码208个氨基酸。 mtcel3具有信号肽序列（l-17aa mrlqaltlsllaaagla)及2个n糖基化位点和3个0糖基 化位点。将mtcel3编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，尚未发现相关报道。
[0006] 构建重组表达质粒载体ppic9k/mtcel3,利用电转仪进行电击转化pichia pastoris gs115,在md和丽培养基上筛选，经pcr鉴定筛选阳性转化子，g418筛选多拷贝 转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株gs-mt-cel3。该工程菌株接种于 含bmgy培养基中，在28°c 200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为3. 8mg/ml， 分子量为27. 2kda，对羧甲基纤维素的水解活力高达47. 51u/mg，对微晶纤维素的水解活力 为4. 33u/mg，mtcel3在60°c下是稳定的，处理lh后仍有95%以上的酶活性；70°c处理lh 后仍保持78%的活性；80°c处理lh后保持25%的活性；90°c处理lh后保持8%。
[0007] 耐热糖苷水解酶mtcel3对长链纤维素具有很强的水解能力，其对羧甲基纤维素 的水解活力高达47. 51u/mg，对微晶纤维素的水解活力为4. 33u/mg，对脱脂棉的水解活性 为12. 21u/mg，对滤纸的水解活性为8. 82u/mg。并且mtcel3有很好的热稳定性，在70°c的 处理lh条件下仍可以保持78%的活性，具有很好的工业应用前景。 (四）
【附图说明】
[0008] 图1耐热糖苷水解酶mtcel3的sds-page分析
[0009] 泳道1 :低分子量蛋白标准
[0010] 泳道2 :纯化的耐热糖苷水解酶mtcel3 [0011]图2a:耐热糖苷水解酶mtcel3的最适温度
[0012] b:耐热糖苷水解酶mtcel3的热稳定性测定
[0013] 图3耐热糖苷水解酶mtcel3的最适ph
[0014] 图4耐热糖苷水解酶mtce 13水解羧甲基纤维素产物的tlc分析
[0015] 泳道1 :标准寡糖（dp2-dp7)
[0016] 泳道2:水解羧甲基产物 (五）【具体实施方式】
[0017] 实施例1 :嗜热毁丝菌myceliophthora thermophila的分离鉴定
[0018] (1)标本采集：从堆肥中采集。
[0019](2)分离培养：将采集标本取0. 5克放置在pda平板上50°c培养3天后，进行分离 纯化。操作步骤参考cooney and emerson (1964)文献。
[0020] (3)鉴定：参考cooney and emerson(1964)和latouche(1950)文献。
[0021] 实施例2 :耐热糖苷水解酶基因mtcel3的克隆
[0022](1)嗜热毁丝菌myceliophthora thermophila总 rna 的提取：参照trizol试剂 盒说明。
[0023] (2) cdna 第一条链的合成：按照 takara 公司的 takara rna pcr kit (amv) ver3. 0 试剂盒说明书进行：取1~2 y g总rna，加rnase free ddh20至9. 5 y l，将rna样品在75°c 变性5 m i n，立即在冰浴中冷却5 m i n，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成 分：10mmol/l dntp mixture 2yl，10xrt bufter(mg2 )2yl，25mmol/l mgcl24yl，oligo d (t)-adaptor primer 1 y l, rnase inhibiter 0.5 y l, amv reverse transcriptase 1 y l(final volume 20 y l)，将反应液混合后，室温下放10min，然后42°c温育60min，再煮 沸5min以灭活反转录酶。加入180 y l depc处理的ddh20,稀释至200 y l，混勾，稍微离心， 保存于-20 °c，备用。
[0024] (3)pcr反应（25yl) :cdna 2yl，loxbuffer 2. 5yl，10mmol/l dntp2yl， 25臟〇1/11%(：1221^，上、下游引物各21^，了39〇嫩聚合酶0.5 1^(5。/1^)，(1(1112012 1^。 反应条件为94°c 5min预变性；94°c 40s，52°c 40s，72°c lmin，共32个循环，72°c延伸 10min，4°c保存。
[0025] 上游引物：5 ' -atgagactccaagccctgac-3 '
[0026] 下游引物：5 ' -ctactcatccittgcgatcac-3 '
[0027] (4)基因克隆：取0.5ylpcr产物与pmd18-t载体进行连接，操作步骤按照 takara公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌dh5a菌株，在表面涂有氨卞青 霉素（100 ug/ml)的lb平板上生长过夜。挑取白色菌落，在lb液体培养基中培养过夜。
[0028] (5)质粒dna的提取：碱法提取质粒dna。
[0029] (6)序列测定：dna双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序 列引物为m13启动子引物。嗜热毁丝菌mtcel3基因cdna全长627bp，包含起始密码子和终 止密码子，无内含子，编码208个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，尚未 发现报道。该序列如下：
[0030] (a)seq id no 1 的信息
[0031] (a)序列特征：*长度：627碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性
[0032] (b)分子类型：dna
[0033] (c)假设：否
[0034] ⑷反义：否
[0035] (e)最初来源：嗜热毁丝菌 myceliophthora thermophila
[0036] (f)序列描述：
【主权项】
1. 一种新型嗜热毁丝菌（myceliophthorathermo地ila)糖巧水解酶化cel3及其编 码序列和应用，其特征是该水解酶是一种尚未报道的热稳定内切糖巧水解酶，具有良好的 纤维素酶活性。通过rt-pcr方法从嗜热毁丝菌获得糖巧水解酶基因mtcel3,将该基因克 隆到毕赤酵母分泌型表达载体ppic9k，获得表达重组质粒ppic9k/mtcel3,转化毕赤酵母 gs115,从中筛选出表达热稳定糖巧水解酶基因化cel3的毕赤酵母工程菌株gs-mt-cel3， 其表达产生的糖巧水解酶化cel3对纤维素具有很高的内切水解酶活性；其中，所述嗜热毁 丝菌糖巧水解酶化cel3核巧酸序列如seqidno. 1所示。 注意事项 一、 申请发明专巧或者实用新型专利应当提交权利要求书，一式一份。 二、权利要求书应当打宇或者印刷，字迹应当整齐清晰，呈黑色，符合制版要求，不得涂改，字高应当在 3. 5毫米至4. 5毫米么间，巧距应当在2. 5毫米至3. 5毫米之间，权利要求书凯发k8娱乐首页用此页，续页可使 用同样大小和质量相当的白纸。纸张应当缴向使用，只限使用正面，四周应当留有页边距：左侧和顶 部各巧毫米，右侧和底部各15毫米。 s、权利要求书应当说明发明或者实用新型的技术特征，清楚和简要地表述请求保护的范围。权利要求书 有几项权刹要求时，应当用阿拉化数字顺序编号.菊号前不得冠w"权利要求"或者"权项"等词。 四、 权利要求书中使用的科技术语应当与说明书中使用的一致，可w有化学式或者数学式，必要时可w有 表格，但不得有插图。不得使用"如说明书……部分巧述"或者"如图……巧示"等用语。 五、 每一硕权利度求仅允许在权利巧求的结展化使用句号。 六、 权不0要求书应当巧毎页下框线居中位置顺序编写页码。
【专利摘要】本发明是一种新型热稳定的嗜热毁丝菌myceliophthora thermophila糖苷水解酶mtcel3及其编码序列和应用。通过rt-pcr方法从嗜热毁丝菌myceliophthora thermophila中获得糖苷水解酶基因mtcel3，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体ppic9k中，然后将得到的糖苷水解酶基因mtcel3表达载体ppic9k/mtcel3导入到毕赤酵母gs115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因mtcel3的酵母工程菌gs-mt-cel3其表达产生的糖苷水解酶mtcel3对纤维素具有很高的内切水解酶活性。mtcel3具有良好的热稳定性和很强的水解纤维素能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。
【ipc分类】c12n15-81, c12n15-56, c12n9-42, c12r1-84
【公开号】cn104789580
【申请号】cn201510222269
【发明人】李多川, 韩超, 陈宸
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月5日