一种利用双酶协同水解制备章鱼钙螯合蛋白肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种金属ca螯合肽，更具体地涉及了一种利用碱性蛋白酶和风味蛋 白酶二步分别酶解章鱼蛋白制备的ca螯合肽，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 在章鱼的养殖和加工过程中，大量的章鱼下脚料被作为垃圾废弃堆积，腐烂发臭， 甚至变质，而造成经济的损失，并引起严重的环境污染等问题。章鱼作为一种高档海产，在 进行加工过程中，其废弃下脚料的比例可占达45%以上，包括内脏、软骨、眼球、脖子等，而 这些下脚料中含有丰富的蛋白质、氨基酸及一些活性成分如牛磺酸、肉碱等，却都未得到充 分利用。目前，国内外多是关于章鱼的生命体征及信息物质等方面的研究，而关于章鱼下脚 料的开发利用，及其副产品的研发探究的报道甚少。随着活性肽研究与产品开发的兴起，我 们发现章鱼蛋白源生物活性肽具有极高的营养价值、食用安全性及生理保健功能，可作为 功能性食品或食品添加剂乃至药品应用到人们日常生活中。
[0003] 目前，钙元素缺乏是全球性的营养问题，我国人民由于以植物性膳食为主，缺钙的 现象更加严重，因此补钙成为我国膳食营养研究中的重要课题。传统的无机钙盐，如碳酸 钙、磷酸钙、氯化钙等，对维生素有一定破坏作用，生物学效价较低；有机钙盐，如柠檬酸钙、 乳酸钙、葡萄糖钙等，虽然钙吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且价格高。研究表明， 蛋白肽螯合钙由于其独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补 充多肽和钙，而成为补钙首选。
[0004] 因此，如何获得具有金属螯合钙活性的肽，就成为制备新型钙补充剂迫切的研究 方向。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种利用碱性蛋白酶及风味蛋白酶二步酶解章 鱼蛋白制备的金属螯合肽，使金属ca螯合活性得以高效地实现。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种金属ca螯合肽，是由4个氨基酸所构成的四肽。所述多肽的氨基酸序列为：vevd。
[0007] -种金属ca螯合肽的制备方法，以章鱼蛋白为原料，采用碱性蛋白酶及风味蛋白 酶复配对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽。
[0008] 所述酶解条件为：酶解章鱼下脚料的最适酶解条件为料液比1:6,酶解时间5. 5h， 温度51°c;在碱性蛋白酶酶解的基础上，再添加风味蛋白酶进一步酶解。
[0009] 所述酶为碱性蛋白酶和风味蛋白酶，双酶分步水解的最优条件是：在碱性蛋白酶 酶解5. 5h后，加入风味蛋白酶继续酶解3. 5h。
[0010] 所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用t0y0pearldeae-650m阴离子交 换色谱进行分离，洗脱液为浓度梯度为含有〇_〇. 5mnacl的0.02mol/lph9.0的磷酸缓 冲液，流速为0. 5ml/min，洗脱峰在214nm下进行测量；收集具有最高ca螯合活性的峰， 再用sephadexg-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0. 3ml/min，洗脱 峰在214nm下进行测定；收集具有最高ca螯合活性的峰，利用半制备rp-hplc-c18反相 高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-90% (v/v)乙腈溶液作为洗脱液梯度洗 脱，至90%乙腈和10%水（v/v)的混合液结束，进行梯度洗脱，洗脱时间为45min，流速为2 ml/min，收集具有最高金属ca螯合活性的峰即保留时间为31. 212min的洗脱峰，具有最 高金属ca螯合活性，得到所述的金属螯合肽。
[0011] 本发明采取的具体步骤如下： (1)章鱼蛋白酶解条件的优化 本技术所采用的章鱼蛋白来自东山博广天兴食品股份有限公司（中国?福建)，酶购自 诺维信生物技术有限公司（中国?天津)。采用单因素实验，分别对四个酶解因素进行考察， 分别为底物浓度（1%，3%，5%和7%)、酶解温度（40，50，55和60°c)、料液比（1:2、1:3、1:4、 1:5、1:6、1:7，《八）以及酶解时间（1，3，5，7，9小时)。称取一定质量章鱼蛋白溶解于 蒸馏水中，然后用2mol/lnaoh将其ph调节至8. 0。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着 再按不同的酶-底物配比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水 浴中灭酶10分钟，冷却后再loooorpm离心10分钟。上清液收集后，分别对金属ca螯合活 性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到具有最大金属螯合活性的酶解液的酶解条件是：底 物浓度5%，酶解ph为8. 0、最适酶解条件为料液比1:6，酶解时间5. 5h，温度51 °c。在碱性 蛋白酶酶解5. 5h后，加入风味蛋白酶继续酶解3. 5h，底物浓度5%，酶解ph为8. 0、最适酶 解条件为料液比1:6，温度51°c。
[0012] (2)酶解产物的分离、纯化 先在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过t0y0pearl deae-650m阴离子 交换色谱(长l〇〇cm，外径2. 0cm)进行分离，洗脱液为浓度梯度为0-0. 5 μ的nacl的0. 02 mol/l ph 9. 0的磷酸缓冲液，流速为0. 5 ml/min，洗脱峰在214nm下进行测量；收集具有最 高ca螯合活性的峰，再用sephadex g-25凝胶过滤色谱(长50 cm，外径1.6 cm)进行分离， 洗脱液为去离子水，流速为〇. 3 ml/min，洗脱峰在214 nm下进行测定；收集具有最高ca螯 合活性的峰，利用半制备rp-hplc-c18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是 用0-90%(v/v)乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，至90%乙腈和10%水（v/v)的混合液结束， 进行梯度洗脱，洗脱时间为45 min，流速为2 ml/min，收集具有最高金属ca螯合活性的峰 即保留时间为31. 212 min的洗脱峰，具有最高金属ca螯合活性，得到所述的金属螯合肽。
[0013] ⑶金属螯合活性的测试 钙螯合活性的测试是金属螯合肽对钙离子的螯合作用。本发明将1ml5mmol/l的cacljp2ml0.2mol/l的磷酸盐缓冲液（ph8.0)加入具塞试管中，再加入1ml清蛋白 肽溶液，置于恒温加热水浴摇床中37°c温育2h，取出后10000r/min常温离心10min。取 1ml上清液，加入邻-甲酸酞显色液5ml，摇勾。放置10min后于分光光度计570nm处 测定吸光值，将数值代入标准曲线中计算出可溶性钙结合量。
[0014] 标准曲线的制作：分别取标准ca工作液（10ug/ml)0,0.2,0.4,0.6,0.8，1.0 ml于10ml试管中，分别加去离子水1. 0,0. 8,0. 6,0. 4,0. 2,0ml，加入邻-甲酸酞显色液5 ml，摇勾，放置10min后于分光光度计570nm处测定吸光值。以可溶性|丐含量（ug/ml)为 横坐标，吸光值为纵坐标做图，得标准曲线公式为：y = 0