一种长效胰岛素衍生物及其制备方法和用途与流程-凯发k8娱乐

本发明属于医药，尤其涉及一种长效胰岛素衍生物及其制备方法和用途。

背景技术：

1、胰岛素(insulin,缩写:ins)是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素参与调节糖代谢，控制血糖平衡，可用于治疗糖尿病。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。

2、在胰岛素的百年历史中，人类利用胰岛素探索治疗糖尿病尤其是i型糖尿病的进程从未停止。从猪牛等动物源胰岛素逐渐过渡到人源胰岛素，从提取胰岛素逐渐过渡到半合成与生物基因重组胰岛素，从超短效逐步开发出短效、中效、长效胰岛素以及预混等等不同类别的胰岛素。由于胰岛素的高活性，其最常见的不良反应是低血糖，多见于1型糖尿病中脆性型或2型糖尿病中重型，特别是消瘦者，严重时可能危及生命安全。

3、诺和诺德公司团队在该领域进行了长足的探索研究，其中一个命名为insulinicodec的胰岛素类似物脱颖而出，目前正在进行临床ⅲ期试验，临床初步数据显示了良好的发展潜力。其人体196小时的超长半衰期和适宜的胰岛素活性是其典型特征。

4、其它还有mk-2640等类似的尝试。

5、在本领域如何延长胰岛素半衰期、保持胰岛素足够的活性又减少低血糖反应是药物开发的难点也是科技工作者孜孜以求的目标。现有技术无法根治i型糖尿病，因此在代谢性疾病和更多领域探索更多更好的长效胰岛素类药物没有终点。

技术实现思路

1、本发明提供了一种长效胰岛素衍生物(类似物)或其盐，所述长效胰岛素衍生物有两类，类别一为式(i)所示，主链中(b)链末端的x1有且仅有一个其侧链的氨基连接式(ii)所示支链的羧基并形成酰胺：

2、

3、其中，x1为赖氨酸(lys)，其侧链的ε氨基连接式(ii)右端的羧基构成酰胺；z为十八烷二酸或二十烷二酸，其一端羧基与谷氨酸的α氨基以酰胺键形式连接。

4、类别二为式(iii)所示，主链中(b)链末端的x2有且仅有一个其侧链的氨基连接式(ii)所示支链的羧基并形成酰胺：

5、

6、其中，x2为赖氨酸(lys)，其侧链的ε氨基连接式(ii)右端的羧基构成酰胺；z为十八烷二酸或二十烷二酸，其一端羧基与谷氨酸的α氨基以酰胺键形式连接。

7、为了便于识别和表述，胰岛素类似物a链采用(a)画图表述，避免与氨基酸ala的缩写a形成混淆。类似地，胰岛素类似物b链采用(b)表述。

8、在本发明的一种实施方案中，所述长效胰岛素衍生物为下列式(iv)：

9、

10、在本发明的一种实施方案中，所述长效胰岛素衍生物为下列式(v)

11、

12、在本发明的一种实施方案中，所述长效胰岛素衍生物为下列式(vi)

13、

14、在本发明的一种实施方案中，所述长效胰岛素衍生物为下列式(vii)

15、

16、本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和( )-对映体、(r)-和(s)-对映体、非对映异构体、(d)-异构体和(l)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。在本发明的实施方案中，作为本发明的优选实施方式，所述的多肽化合物其中的氨基酸均优选为l型氨基酸。

17、文中表述的氨基酸均为国际标准单字母或三字母缩写。按惯例，除特殊标注为d型氨基酸以外，一般氨基酸缩写均默认为l型。

18、另一方面，本发明提供了一种上述长效胰岛素衍生物的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

19、1)固相合成支链片段；

20、2)固相法合成肽链(含(a)和(b)链间氧化反应构建二硫键)；

21、3)将支链片段与肽树脂偶联；

22、4)裂解除去保护基团与树脂挂载，得到长效胰岛素衍生物。

23、在一些实施例中，所述步骤合成主链的方案如下所示：

24、按本发明分子结构的(b)链氨基酸顺序将fmoc保护氨基酸依次偶联到固相合成树脂上，其中最后一个氨基酸phe的α氨基采用boc基团保护；采用特殊脱保护方法脱去(b)链b19位(自n端向c端方向计)cys的侧链保护，二硫键反应并挂载(a)链a20位保护的cys；特殊脱保护方法脱去(a)链a20位cys的羧基端保护，缩合偶联(a)链a21位保护的asn；再按本发明分子结构的(a)链剩余氨基酸顺序将fmoc保护氨基酸依次偶联到肽树脂上；特殊脱保护方式脱去cys的侧链保护，按本发明分子结构反应构建二硫键。

25、在一些实施例中，所述步骤固相法将支链各模块逐次与肽树脂偶联的方案如下：

26、该步骤采用多肽固相合成的方式进行，按本发明支链各模块结构顺序依次逆序连接到树脂上的多肽主链。先脱去x1或x2(lys)的侧链保护，连接单保护的3,6-二氧杂-辛二酸，再连接fmoc保护的3,6-二氧杂-1,8-辛二胺，再连接保护的glu，最后连接十八烷二酸(或二十烷二酸)单叔丁酯完成整个支链的上载与合成。

27、在一些实施例中，所述固相法合成肽链与固相法将支链各模块逐次与肽树脂偶联步骤可阶段性实施用以合成与构建本发明所述多肽化合物，如将支链各模块预先合成为片段中间体，或将氨基酸预先合成为多肽片段等。

28、在一些实施例中，裂解除去保护基团与树脂挂载步骤的方案如下

29、采用一定配比的tfa裂解液，再采用醚类试剂将粗品沉淀结晶出来，所得类白色粉末为部分还原型胰岛素衍生物。

30、在一些实施例中，所述步骤氧化反应构建二硫键的方案还可以在固相合成构建完长效胰岛素衍生物肽链再裂解后采用液相方式，如部分还原型胰岛素衍生物用水溶液或含dmso的水溶液溶解，调ph后加入氧化剂反应，最终至完全氧化，也可得到本发明所述胰岛素衍生物的粗品水溶液。该实施方案在现有技术上的变化不得作为约束本发明制备方法实施的限制条件。

31、可选地，进一步包括：色谱纯化：进行多步反相色谱纯化或离子色谱纯化，最后转盐成含活性成分的水溶液；和冻干。

32、本发明前后文表述中所采用的一些化学基团或化学试剂或分子式的缩写均为本专业领域内常见和公知的缩写方式，不逐个列举其具体含义，但不影响其具体指向。

33、本发明公开了一种药物组合物，其包含本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，以及药学上可接受的载体。

34、构成本发明的一部分是药学上可接受的盐，适当的“药学上可接受的盐”包括本发明的游离型化合物、无机酸或有机酸反应形成的本发明化合物的常规无毒盐、无机碱或有机碱反应形成的本发明化合物的常规无毒盐。例如，包括得自无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等的盐，也包括得自有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸、三氟乙酸等的盐。又例如，包括得自无机碱例如钠、钾、钙、镁、锌、铁等的盐，也包括得自有机碱例如氨水、精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、组氨酸等的盐。

35、本发明的其中一个目标是根据本发明的胰岛素衍生物研究开发成为临床可用的药物制剂。该制剂可进一步包含缓冲剂、防腐剂、等渗剂、助溶剂、张度剂、螯合剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、酸碱调节剂等。浓度通常为0.01mg/ml至50mg/ml，其中所述的制剂具有3.0至9.5的ph。

36、在本发明的一个实施方案中，药物制剂是含水制剂，即水溶液，通常是溶液、乳液或混悬液。

37、在另一个实施方案中，药物制剂是一种冻干制剂，在使用前加入溶剂和/或稀释剂至其中充分溶解后备用。

38、在另一个实施方案中，药物制剂是不需预先溶解的即用型干燥制剂，例如喷雾吸入冻干粉等。

39、在本发明的另一个实施方案中，药物制剂ph值的范围选择至关重要，会影响到胰岛素衍生物的溶解性和稳定性，在某些特定条件下会产生多肽物理性聚集或吸附。在本发明的一个实施方案中，药物制剂的ph值为3.0～5.0。在本发明的一个实施方案中，药物制剂的ph值为7.5～9.0。在本发明的一个实施方案中，药物制剂的ph值为6.5～8.0。在本发明的另一个实施方案中，药物制剂的ph值为5.0～7.5。

40、在本发明的进一步实施方案中，缓冲剂选自磷酸氢二钠、乙酸钠等，防腐剂选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚等，等渗剂选自氯化钠类盐、糖或糖醇、氨基酸、丙二醇、甘露醇等，助溶剂选自甘露醇、丙二醇、peg、甘油、吐温、乙醇等，张度剂选自氯化钠类盐、丙二醇、甘油、甘露醇等，螯合剂选自edta、柠檬酸盐等，稳定剂选自肌酐、甘氨酸、烟酰胺、peg等，抗氧化剂选自亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、半胱氨酸、甲硫氨酸等，表面活性剂选自聚山梨酯、甘油、甘露醇等，酸碱调节剂选自盐酸、磷酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾等。

41、其它成分可根据药物制剂的需要(例如长期稳定性)存在于本发明胰岛素衍生物的药物制剂中，包括乳化剂、金属离子、油质载体、蛋白质(如人血清白蛋白、明胶或蛋白质等)以及两性离子(例如精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、甜菜碱和牛磺酸等)等和其它药用制剂添加剂。

42、术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂载体或介质，代表性的载体包括水、油、脂质体等。

43、针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。

44、术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。

45、“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。

46、本发明公开的所述长效胰岛素衍生物的制备方法或方案采用的是化学合成的方式，但按现有技术手段设想，这类化合物可采用基因表达与重组并结合化学合成的半合成方式构建本发明所述长效胰岛素衍生物。所有这些可实施方案，均应包括在本发明的范围之内。

47、第三方面，本发明提供了上述长效胰岛素衍生物的用途，所述的用途包括但不限于在制备治疗或预防下述至少一种疾病的药物中的应用，所述疾病包括i型糖尿病、ii型糖尿病、妊娠糖尿病以及胰岛素缺乏或抵抗的相关疾病。糖尿病包括以因胰岛素分泌、胰岛素作用或其二者的缺陷引起的高血糖为特征的一组代谢疾病。

48、第四方面，本发明通过研究惊奇地发现，经过本发明特殊支链修饰后的胰岛素衍生物具有非常优异的药代动力学参数，尤其是良好并突出的生物利用度，并部分展现在药效实验上成为独特优势，对比现有技术有显著的技术进步。